細胞凋亡（Apoptosis）是一種程序性細胞死亡 (PCD)，其特征包括細胞皺縮、染色質凝聚、膜起泡和核碎裂。它對于形成和維持健康組織至關重要，幾乎所有生物體在早期胚胎發育過程中都依靠細胞凋亡來清除多余細胞。它也是維持組織穩態的關鍵環節，通過清除衰老或受損細胞來平衡細胞群體的增殖與死亡。

很多人在做凋亡實驗時，*常問的坑就是：“Annexin V 陽性了，但 Caspase-3 沒激活？”“JC-1 紅綠比下降了，是凋亡還是壞死？”“Sub-G1 峰怎么算比例？”今天這篇文章從凋亡原理入手，系統梳理主流檢測方法：Annexin V/PI、JC-1、Caspase-3/7活性、7-AAD、TUNEL、PARP裂解、Sub-G1、Cytochrome c 釋放等。重點講解原理、實驗步驟、數據解讀和多參數組合（流式為主，但也包括 WB、IF、顯微鏡等）。讀完后，你能全面掌握凋亡實驗的設計與驗證，避免假陽性/假陰性。

核心提醒：凋亡分階段
早期：磷脂酰絲氨酸（PS）外翻、ΔΨm 下降、Caspase 激活
中期：DNA 片段化、細胞收縮
晚期：膜破裂、壞死樣特征
凋亡 vs. 壞死 vs. 焦亡：需多標志物區分（Annexin V+ PI- = 早期凋亡；Annexin V+ PI+ = 晚期凋亡/壞死）。

一、細胞凋亡生物學基礎

凋亡分兩條主要通路：

• 外源性（死亡受體通路）

Fas/TNF-α 等配體 → 死亡誘導信號復合物（DISC） → Caspase-8 → Caspase-3/7 執行。

• 內源性（線粒體通路）

應激 → Bcl-2 家族調控 → 線粒體外膜通透（MOMP） → Cytochrome c 釋放 → Apaf-1/Caspase-9 → Caspase-3/7。

關鍵事件：PS 外翻、ΔΨm 下降、Caspase 級聯激活、DNA 斷裂（180-200 bp 多聚體）、細胞收縮、凋亡小體形成。

二、主流檢測方法原理與優缺點

1. Annexin V/PI 雙染（流式金標準）

原理：Annexin V 結合外翻的 PS（Ca2? 依賴），FITC/APC 標記；PI 進入膜破裂細胞。早期凋亡：Annexin V+ PI-；晚期：Annexin V+ PI+；壞死：Annexin V- PI+。

優點：活細胞兼容、早期檢測；缺點：需 Ca2? 緩沖液，背景需對照。

2. JC-1 檢測線粒體膜電位下降

原理：JC-1 在高 ΔΨm 聚合紅光，低 ΔΨm 單體綠光。凋亡早期 ΔΨm 崩解 → 紅/綠比下降。

優點：內源通路早期標志；缺點：非特異（其他損傷也可降 ΔΨm），需 CCCP 陽性對照。

3. Caspase-3/7 活性檢測

AMC）或抗體檢測激活 Caspase-3/7。流式用熒光偶聯底物或抗活性 Caspase-3 抗體。

優點：執行階段特異；缺點：需裂解或固定，活細胞探針（如 CellEvent）更好。

4. 7-AAD 或 PI 單染（晚期凋亡/壞死）

7-AAD 類似 PI，但更特異進入膜破裂細胞。常與 Annexin V 組合，區分晚期凋亡（Annexin V+ 7-AAD+）與壞死。

5. TUNEL 檢測（DNA 斷裂）

原理：TdT 酶在 DNA 3'-OH 末端標記熒光 dUTP。標記斷裂 DNA 末端。

優點：特異 DNA 片段化；缺點：晚期標志，固定后操作。

6. PARP 裂解（WB）

原理：Caspase-3 切割 PARP（116 kDa → 89 kDa 片段）。WB 檢測裂解片段比例。

優點：下游執行證據；缺點：群體平均，無法區分亞群。

7. Sub-G1 峰（PI 染色中的凋亡碎片）

原理：凋亡細胞 DNA 寡核小體間斷裂 → 小片段泄漏 → PI 熒光 <2N（Sub-G1 峰）。

優點：簡單；缺點：非特異（壞死也可），需結合 Annexin V 驗證。

8. Cytochrome c 釋放（IF / WB）

胞質 → IF 胞質彌散（非點狀線粒體），或分離線粒體/胞質組分 WB。

三、典型實驗操作流程

方案1：Annexin V/PI 流式雙染

1. 細胞處理后，溫和消化（胰酶-EDTA 短時間）或直接收集懸浮細胞，4°C PBS 洗 2 次。
2. 用 1× Annexin V Binding Buffer 重懸至 1×10? cells/mL。
3. 加 FITC-Annexin V（5 μL/100 μL 細胞懸液）+ PI（或 7-AAD，1–5 μg/mL），室溫避光孵育 15–20 min。
4. 補加 400 μL Binding Buffer，1 h 內上機（FL1: Annexin V ~530 nm；FL3: PI/7-AAD ~650 nm）。
5. 門控：FSC/SSC 排除碎片和雙聯體；設單染對照補償串色。
6. 陽性對照：H?O? 或 staurosporine 處理；陰性對照：不加 Annexin V 或無 Ca2? 緩沖液。

方案2：JC-1 染色（線粒體膜電位檢測）

1. 細胞重懸于預熱培養基或 PBS，濃度 1×10? cells/mL。
2. 加 JC-1 工作液（2–5 μg/mL 或 10 μM，根據試劑盒推薦），37°C 避光孵育 15–30 min。
3. 4°C PBS 洗 2 次（去除未結合 JC-1，避免背景），重懸于 PBS 或 Binding Buffer。
4. 流式上機：488 nm 激發，FL1 通道（綠色單體 ~530/30 nm），FL2/FL3 通道（紅色聚合物 ~585/42 或 610/20 nm）。也可熒光顯微鏡拍照。
5. 陽性對照：CCCP（10–50 μM）處理 15–30 min 誘導完全去極化；陰性對照：未處理健康細胞。
6. 數據分析：計算紅/綠 MFI 比值（或圈出“綠色高”亞群比例作為去極化細胞%）；建議用 FlowJo 做紅 vs. 綠雙參數圖。

方案3：Caspase 活性流式檢測

1. 推薦活細胞探針（如 Cell Meter?檢測試劑盒）：按試劑盒說明，1×10? cells/mL 加入 1–2× 工作濃度探針，37°C 避光孵育 1–4小時（期間可輕搖）。
2. 可選雙染：孵育結束后加DNA 染料（例如Green-DCS 用于死細胞）標記細胞，繼續室溫 5–10 min。
3. 上機：FL3 通道（APC Caspase 活性 ~561 nm），FL1 通道（FITC通道 ~488 nm）。
4. 陽性對照：staurosporine（1 μM，4–6 h）或 camptothecin 處理；陰性對照：未處理細胞 + Z-VAD-FMK（廣譜 Caspase 抑制劑）預處理。
5. 數據分析：Caspase+ 細胞比例，或 Caspase MFI 比較。

方案4：TUNEL IF（免疫熒光檢測 DNA 斷裂）

1. 細胞接種于蓋玻片或腔室玻片，處理后用 4% 多聚甲醛（PFA）室溫固定 15–30 min。
2. PBS 洗 3 次，0.1–0.2% Triton X-100 通透 10 min（或用 0.1% 檸檬酸鈉 + 0.1% Triton 通透）。
3. PBS 洗 3 次，加 TdT 平衡緩沖液（Equilibration Buffer）室溫 10 min。
4. 配制 TUNEL 反應液：TdT 酶 + 熒光 dUTP（如 FITC-dUTP 或 Alexa Fluor 488-dUTP），37°C 避光孵育 60 min（濕度盒內）。
5. PBS 洗 3 次，DAPI 或 Hoechst 33342 復染核 5 min。
6. PBS 洗，抗熒光淬滅封片液封片，共聚焦或熒光顯微鏡觀察（488 nm 激發綠，405 nm 激發藍核）。
7. 陽性對照：DNase I 處理（產生人工斷裂末端）；陰性對照：不加 TdT 酶。
8. 解讀：凋亡細胞核呈明亮綠色點狀/彌散熒光（TUNEL+），常伴核濃縮/碎裂；統計 TUNEL+ 細胞比例或每視野 TUNEL+ 核數。

方案5：PARP 裂解 Western Blot

1. 細胞處理后，冰上用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑 cocktail + 1 mM PMSF）裂解 30 min，每 10 min 渦旋一次。
2. 4°C 12,000 g 離心 15 min，取上清，BCA 法蛋白定量（建議 20–40 μg/泳道）。
3. SDS-PAGE（10% 分離膠），轉 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 1 h。
4. 一抗：anti-PARP 抗體（1:1000，通常識別全長 116 kDa 和裂解 89 kDa 片段），4°C 過夜。
5. TBST 洗 3 次，二抗（HRP 標記，1:5000）室溫 1 h，TBST 洗 3 次。
6. ECL 或超敏 ECL 顯影，ImageJ 定量裂解比例：裂解片段% = 89 kDa 灰度 / (116 kDa + 89 kDa) 灰度 × *。
7. 內參：β-actin 或 GAPDH；陽性對照：staurosporine 處理組裂解片段明顯增加。

四、數據解讀與常見問題

• Annexin V/PI 四象限
  Q1 (Annexin- PI+) 壞死；Q2 (Annexin+ PI+) 晚凋亡；Q3 (Annexin+ PI-) 早期凋亡；Q4 活細胞。
• JC-1
  紅/綠比下降 >30% → 早期凋亡。
• Caspase-3
  活性升高 + Annexin V+ → 確認凋亡通路。
• Sub-G1
  比例 >5-10% → 凋亡增加，但需結合其他標志。
• 常見坑
  Annexin V 背景高 → 加 EDTA 對照；JC-1 毒性 → 濃度優化；多參數補償串色 → 單染管校準。

細胞凋亡檢測是多標志物驗證的過程，單一方法容易誤判。希望這篇全面指南幫你設計出可靠實驗，有任何具體問題歡迎留言討論～

聯系我們

  艾思力克提供包括細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗、動物實驗等各項科研服務與各種實驗試劑耗材采購

艾思力克(北京)科技有限公司

北京市大興區科創三街亦莊生物醫藥谷2號樓A7樓1層

艾   博：18510626765（整體項目咨詢）  

李   博：18346662307（動物項目咨詢）

格   格：18510401201（整體業務對接）

于經理：15810756989（整體業務對接）

轉載自公眾號：艾力克思